AZOCONJUGADOS COMO SENSORES DE HIPOXIA

 Resumen del Trabajo de SILVIA GÓMEZ PASTOR, ganador del PREMIO JOSÉ ÁNGEL GÓMEZ DE CASO, VII Edición

 COMPUESTOS ORGÁNICOS NO-FLUORESCENTES BASADOS EN AZOBENCENOS COMO SENSORES DE HIPOXIA

La hipoxia es una condición asociada a niveles bajos de oxígeno en tejidos biológicos o células, que lleva implícita la sobreexpresión de enzimas reductoras. Además, es un síntoma presente en lesiones asociadas a procesos inflamatorios, tejidos isquémicos o tumores sólidos (células cancerígenas). Por lo tanto, la detección de niveles de hipoxia en tejidos es una herramienta muy valiosa para el diagnóstico temprano de las patologías citadas anteriormente. 

Los Azobencenos, una familia de colorantes orgánicos usados en la industria alimentaria, cumplen los requisitos necesarios para poder comportarse como fotointerruptores moleculares. Estos compuestos son capaces de inhibir la fluorescencia de un fluoróforo cuando se encuentran asociados a él. Sin embargo, cuando se produce la ruptura del enlace que los une mediante enzimas reductoras (azoreductasas) se recupera la fluorescencia del fluoróforo. Estas características son claves para la utilización de azocompuestos como sensores de hipoxia. 

En este trabajo, se ha evaluado la capacidad de un azoconjugado (Bodipy-Azo) para utilizarse como sensor de hipoxia y su capacidad de actuar como Fotosensibilizador (FS) para su aplicación en Terapia Fotodinámica (TFD) sobre células tumorales. La TFD es una modalidad terapéutica, mínimamente invasiva, que puede ser usada para patologías oncológicas y que conlleva un estrés oxidativo en las células tumorales que puede derivar en su muerte. Un fotosensibilizador ideal para la TFD debe poseer una toxicidad mínima en ausencia de luz; acumulación preferencial en tejidos neoplásicos y una vida media corta. 

En función de la hipótesis planteada en el trabajo, el objetivo fundamental de este estudio consistió en evaluar la capacidad del azoconjugado (Bodipy-Azo) de actuar como sonda diagnóstica de hipoxia y como FS para su aplicación en TFD. Para alcanzar este objetivo se realizaron distintos ensayos donde se tuvieron en cuenta tres condiciones: Normoxia, Hipoxia y Anoxia. 

En primer lugar, se procedió a evaluar en una línea celular tumoral la toxicidad de estos compuestos (Azoconjugado y Bodipy) en ausencia de luz, obteniéndose de esta manera las concentraciones que no resultaban ser tóxicas en el modelo in vitro utilizado en este estudio (células tumorales HeLa). Posteriormente, se llevaron a cabo ensayos de localización subcelular bajo luz fluorescente y finalmente ensayos de TFD bajo irradiación con una fuente de iluminación formada por diodos emisores de luz (LEDs). 

Para estimar la capacidad fototóxica de estos compuestos, se procedió a la estimación de la viabilidad celular mediante un ensayo colorímetro de MTT, para lo cual se midió la absorbancia de las diferentes muestras a partir de un espectrofotómetro. Una vez analizado el comportamiento del azoconjugado y del fluoróforo en condiciones de normoxia, se llevó a cabo el estudio de su comportamiento en condiciones de hipoxia. 

Nuestros resultados demostraron que el azoconjugado en una situación de baja presión de oxígeno, sufría una ruptura reductora, liberándose el fluoróforo que recuperaba su fluorescencia, detectándola mediante imágenes in vivo bajo un microscopio de fluorescencia. 

A continuación, se procedió a evaluar en situación de baja concentración de oxígeno la capacidad fotosensibilizadora del fluoróforo obtenido tras su ruptura a partir del azocompuesto. Para ello, se llevaron a cabo ensayos de TFD tras distintos tiempos de hipoxia. 

Los resultados nos indicaron que la efectividad del fluoróforo y la cantidad producida de este a partir del azocompuesto, era dependiente del tiempo. De manera que tiempos largos de hipoxia (24h) permitían la generación de fluoróforo en las células, pero la funcionalidad de este disminuía considerablemente. A tiempos cortos (6h) aunque la efectividad del fluoróforo era buena, la cantidad detectada era muy baja y por lo tanto su actividad como FS también. 

Teniendo en cuenta estos resultados, se decidió realizar experimentos en ausencia estricta de oxígeno (anoxia). De esta manera se realizaron los mismos experimentos de localización subcelular y TFD, pero esta vez evitando el acceso de oxígeno a las células. Las imágenes de fluorescencia que se obtuvieron en estos ensayos fueron muy parecidas a las obtenidas tras hipoxia, observando en las células HeLa un incremento en la señal fluorescente del fluoróforo, proporcional al tiempo de anoxia. Por último, se llevó a cabo un ensayo preliminar de TFD en condiciones de anoxia/normoxia en células HeLa tratadas con el azocompuesto. Sin embargo, no se obtuvieron diferencias significativas en la disminución de la viabilidad celular producida por la deprivación total de oxígeno, poniendo de manifiesto la necesidad de continuar nuestro estudio centrándonos en alcanzar este último objetivo. 

Trabajo Realizado por Silvia Gómez Pastor, Graduada en Biología por la Universidad Autónoma de Madrid (UAM) y Dirigido por el Dr. Francisco Sanz-Rodríguez perteneciente al Departamento de Biología de la UAM.